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色譜柱過(guò)載就是那么回事

更新時(shí)間:2021-01-20 點(diǎn)擊次數(shù):8670

 

很多小伙伴在選擇液相色譜柱時(shí)都會(huì)提到一個(gè)問(wèn)題:“這根色譜柱能上多大的樣品量?”誠(chéng)然,小伙伴們?cè)谧龇治龇椒ㄩ_(kāi)發(fā)時(shí)都會(huì)竭力避免色譜柱過(guò)載。因?yàn)橹拥倪^(guò)載會(huì)造成色譜峰峰形失真,以及理論塔板數(shù)過(guò)低的問(wèn)題。

 

特別是小伙伴做有關(guān)物質(zhì)方法開(kāi)發(fā)中,經(jīng)常會(huì)遇到一組分析物中同時(shí)包含了較高濃度的主成分(也就是藥物活性成分)和很低濃度的雜質(zhì)(包括工藝雜質(zhì)及降解雜質(zhì))。而為了兼顧低濃度雜質(zhì)的靈敏度,必然要增大進(jìn)樣體積,或者提高進(jìn)樣濃度,確保定量的準(zhǔn)確性。因此,某些時(shí)候就會(huì)造成色譜柱的過(guò)載。

 

色譜柱的過(guò)載又可以分為質(zhì)量過(guò)載和體積過(guò)載,這里小編就和各位小伙伴聊聊過(guò)載的那些事。

 

質(zhì)量過(guò)載


質(zhì)量過(guò)載又稱(chēng)為濃度過(guò)載,就是指在小體積進(jìn)樣時(shí)(體積未過(guò)載),由于進(jìn)樣濃度較高,靠近譜峰峰帶的固定相被飽和,也就是說(shuō),進(jìn)樣某一組分超過(guò)了色譜柱的載樣量而出現(xiàn)過(guò)載的現(xiàn)象。一般表現(xiàn)為色譜峰峰形拖尾,柱效較低。

在小體積進(jìn)樣時(shí),如果質(zhì)量未超載,隨著樣品量的增加(a<b<c),譜峰面積相應(yīng)增加(Aa<Ab<Ac),但是峰寬并沒(méi)有隨之增加。譜峰也顯正常。


圖1

隨著樣品量繼續(xù)增加,進(jìn)到色譜柱中的樣品達(dá)到飽和,譜峰就變形了。

 

圖2

 

從圖2可以看出,隨著進(jìn)樣質(zhì)量不斷增加,譜峰峰寬不斷增加,z終變成了直角三角形的形狀,同時(shí)譜峰的理論塔板數(shù)也不斷降低。通常,對(duì)于內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱,其載樣量<50μg。如果是做方法轉(zhuǎn)移到其他色譜柱上,則需要調(diào)整進(jìn)樣量,防止出現(xiàn)過(guò)載。

載樣量主要與色譜柱固定相和待分析物的性質(zhì)有關(guān)。首先固定相類(lèi)型不一樣,品牌不一樣會(huì)造成載樣量較大的差異。其次待分析物質(zhì)性質(zhì)也會(huì)直接影響到色譜柱載樣量。例如離子態(tài)的堿性化合物就很容易過(guò)載,不僅無(wú)法達(dá)到<50μg的量級(jí),有時(shí)候甚至1μg的量就能造成過(guò)載的現(xiàn)象。因此在常規(guī)疏水反相中,分子態(tài)的堿性化合物比離子態(tài)的堿性化合物有著更高的載樣量。目前的推測(cè)原因是,離子態(tài)間互相排斥作用使得待分析組分在固定相表面更易達(dá)到飽和而造成過(guò)載。同時(shí)離子態(tài)的帶正電的堿性化合物也更容易和固定相中未鍵合的活性硅羥基發(fā)生次級(jí)相互作用。針對(duì)質(zhì)量超載的問(wèn)題,Z簡(jiǎn)單的方法則是減少進(jìn)樣量。

另外,混合樣品進(jìn)樣中過(guò)載還會(huì)導(dǎo)致峰保留時(shí)間的變化。


圖3

 

例如圖3中,A’,B’為AB組分單獨(dú)進(jìn)樣時(shí)的保留分離情況。A,B為混合進(jìn)樣時(shí)的保留分離情況。過(guò)載的B不管是單獨(dú)進(jìn)樣還是混合進(jìn)樣,均保持穩(wěn)定,而A由于過(guò)量B的存在,在混合進(jìn)樣時(shí),保留時(shí)間提前。

雖然每個(gè)成分的過(guò)載是相對(duì)獨(dú)立的,但是在混合樣品進(jìn)樣過(guò)程中會(huì)引起的分離度問(wèn)題。這是由于環(huán)境對(duì)組分的影響。其中某一組分過(guò)載很可能造成混合進(jìn)樣時(shí)保留時(shí)間相對(duì)于單獨(dú)進(jìn)樣時(shí)有所改變。

 

體積過(guò)載


進(jìn)樣體積太大通常會(huì)導(dǎo)致較寬的平頭峰。
 

圖4

 

從圖4可以看出,隨著進(jìn)樣體積的增大,峰寬逐漸變寬,峰分離度降低。

另外體積過(guò)載還會(huì)影響峰保留時(shí)間,體積過(guò)載對(duì)保留時(shí)間短的組分影響更大,而對(duì)于較后面流出的峰影響較小。
 

圖5

 

圖5中虛線為正常體積進(jìn)樣,實(shí)線色譜圖為體積過(guò)載后的色譜圖。

 

那么,如何選擇合適的進(jìn)樣體積呢?
對(duì)于在z佳流速下 ,允許樣品進(jìn)樣的Z大體積為:

 


 

其中:L為柱長(zhǎng)(mm),dc為內(nèi)徑(mm),dp為粒徑(μm)

 

如果小伙伴嫌棄公式太繁瑣,也沒(méi)有關(guān)系,貼心的小編已經(jīng)主動(dòng)把我們常用的各規(guī)格色譜柱列出:
 


注:z大進(jìn)樣體積作了近似整數(shù)處理
盡管上表中各個(gè)數(shù)據(jù)是嚴(yán)格按照公式計(jì)算出來(lái)的,但是這個(gè)數(shù)據(jù)并不。色譜是經(jīng)驗(yàn)科學(xué),較之其他學(xué)科需要更多的實(shí)踐。當(dāng)然,理論也為我們指引了方向,讓我們能少走彎路。

各位小伙伴想了解更多有關(guān)色譜柱的知識(shí),請(qǐng)咨詢(xún)?cè)滦癞?dāng)?shù)劁N(xiāo)售人員。

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