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牛初乳粉中IgG蛋白的分離純化及檢測(cè)方法

更新時(shí)間:2022-03-31 點(diǎn)擊次數(shù):1144

免疫球蛋白G,即抗體,是免疫系統(tǒng)用來識(shí)別和中和病原菌和病毒等異物的Y型大蛋白,在生物學(xué)上十分重要。Protein G可以結(jié)合哺乳動(dòng)物IgG,與其蛋白結(jié)構(gòu)上的Fc片段進(jìn)行特異性識(shí)別。因此可以選用月旭Welchrom® Protein G Tanrose 4FF(5mL,00081-12012)來分離純化牛初乳粉中的IgG蛋白、Welchrom® BC-10重力柱(8.3mL,00051-32022)提高純度,并采用月旭Xtimate® SEC-300(7.8×300mm,5μm)進(jìn)行色譜檢測(cè)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。





01分離純化實(shí)驗(yàn)步驟

(1)牛初乳樣品預(yù)處理

① 去除脂肪及酪蛋白:

A. 取3g牛初乳粉溶于20mM PB中,漩渦震蕩混勻充分溶解,定容至30mL ,濃度為1g/mL。

(可滴加少許消泡劑,約4μL/mL)

B.用6M HCl調(diào)pH至4.5,37℃ 水浴35min,9000r/min 離心20min,棄沉淀,保留上清。

② 去β-乳球蛋白:

將上述上清用10M NaOH回調(diào)pH至7.0,9000r/min 離心20min,棄沉淀,保留上清。

③ 去除小分子雜蛋白及脫鹽濃縮樣品:

將上述上清倒入30kDa超濾管中,8000r/min 離心10min,收集截留液。

④ 除微生物雜質(zhì):

將截留液過0.45μm濾膜,準(zhǔn)備上樣。

(2)Protein G 4FF親和純化(280nm)


微信截圖_20220331160404.png

(3)SDS-PAGE電泳測(cè)定純度


① 10×電泳緩沖液配置(1L):


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② 上樣:

按4:1=樣品:5×Loading Buffer 的比例加入上樣緩沖液混勻,沸水浴5-10min,據(jù)樣品情況選擇上樣量,Marker 5μL/孔,濃縮膠80V 20min,分離膠120V 60min電泳。

③ 染色及脫色:

用染色液染色30min,用蒸餾水清洗后,查看結(jié)果。


(4)BC-10重力柱脫鹽(8.3mL)


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02 檢測(cè)分析實(shí)驗(yàn)步驟


液相色譜檢測(cè)


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03 目標(biāo)蛋白凍干保存


①超濾濃縮 → ②-20℃預(yù)凍干 → ③-80℃真空凍干 → ④凍干樣品復(fù)溶純度色譜檢測(cè) → 蛋白凍干-20密封保存。


04 結(jié)果如圖


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05 結(jié)論


采用月旭Welchrom® PreCot Protein G 4FF(5mL,00081-12012)與月旭Welchrom® BC-10重力柱(8.3mL,00051-32022)兩種層析柱進(jìn)行二次層析,可以使樣品純度達(dá)到97%,再經(jīng)30kD超濾管進(jìn)行濃縮可進(jìn)一步提升樣品純度,經(jīng)月旭Xtimate® SEC-300(7.8×300mm,5μm)色譜檢測(cè)純度達(dá)到99.86%。


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