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干貨 | 固相萃取實(shí)驗(yàn)成敗的影響因素、常見問題

更新時(shí)間:2023-06-20 點(diǎn)擊次數(shù):1262

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固相萃取主要影響因素

固相萃取是一個(gè)目標(biāo)物在固定相上吸附、解吸附/洗脫的過程,因此影響吸附、解吸附、洗脫的因素都會(huì)直接影響萃取的效率,如填料類型、洗脫溶劑的強(qiáng)度、pH、流速等。

填料

填料是固相萃取技術(shù)的核心,選擇對目標(biāo)物具有適中吸附性的 SPE柱填料是確保檢測準(zhǔn)確的前提。當(dāng)然針對同一種目標(biāo)物,我們可以選擇不同的柱料,但是要注意方法的調(diào)整。

洗脫溶劑的強(qiáng)度

固相萃取是固定相-填料與流動(dòng)相-上樣溶劑/洗脫溶劑對目標(biāo)物的競爭吸附作用,所以在上樣時(shí),要選擇有機(jī)溶劑含量或pH都合適的上樣液,以避免目標(biāo)物在上樣時(shí)漏掉。而在洗脫時(shí),也必須選擇適合的溶劑強(qiáng)度,即有機(jī)溶劑的含量或pH,以確保能將吸附在填料上的目標(biāo)物徹di洗脫下來。

pH

對于離子交換固定相,被分析成分與干擾物質(zhì)的pKa(等電點(diǎn))各不相同。通過調(diào)節(jié)溶劑pH的大小,可以使固定相帶電荷,被分析物帶相反電荷,而使干擾物質(zhì)不帶申荷:或使固定相帶申荷,干擾物質(zhì)帶相反申荷,而使被分析物不帶電荷。

流速

上樣流速和洗脫流速會(huì)影響吸附或解吸附/洗脫的效果,上樣和洗脫的流速一般控制在1mL/min以內(nèi)。對于大量樣品痕量富集,如環(huán)境水樣中有機(jī)物的富集,上樣流速不超過5mL/min。除了以上的幾個(gè)因素,一些操作步驟完成的情況,如活化的程度、淋洗步驟的抽干等,也會(huì)影響結(jié)果的回收率或重現(xiàn)。

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固相萃取過程Q&A

1. 為什么SPE小柱操作要強(qiáng)調(diào)流速?

答:大多數(shù)實(shí)驗(yàn)人員都希望實(shí)驗(yàn)做的又快又好,在固相萃取實(shí)驗(yàn)中,往往偏好用比較快的流速過柱。這里就必須要注意流速太快的弊端。因?yàn)?span style="margin: 0px; padding: 0px; outline: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box !important; overflow-wrap: break-word !important; letter-spacing: 1.2px;">SPE小柱的填料裝填壓實(shí)以后,形成柱床,當(dāng)溶劑流過小柱,速度過快將導(dǎo)致兩個(gè)問題,一個(gè)問題是對于鍵合相填料,由于流速快而使得其不能充分浸潤舒展,因而導(dǎo)致其保留活性降低;其次過快的流速導(dǎo)致小柱可能形成溝渠,使得填料未被充分浸潤,降低了吸附填料與樣品的接觸面積,影響了目標(biāo)物質(zhì)的傳質(zhì)過程,因而導(dǎo)致回收率降低。

2. 溶劑環(huán)境的pH怎么影響化合物在小柱上的保留?為什么我們要關(guān)注化合物的pKa值?在C18小柱中需要考慮這些因素嗎?

答:首先我們來說一下,Ka指的是酸度系數(shù),又名酸離解常數(shù),可以理解為酸離解H離子的能力,而pKa=-lgKa,對于酸,在環(huán)境pH下存在如下平衡:

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左邊的A-/HA,實(shí)際是指溶劑環(huán)境下,離子態(tài)和分子態(tài)的比例,右邊反映了左側(cè)兩者的轉(zhuǎn)化關(guān)系,取決于(pH-pKa)的數(shù)值大小。對于離子交換小柱,保持目標(biāo)物的離子化而非分子態(tài),是一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn),這對于離子交換作用機(jī)理的交換柱,將直接關(guān)系到其實(shí)驗(yàn)成敗。而對于硅膠鍵合C18小柱的萃取,由于硅膠(—SiOH)不能wan全“封端",在pH大于4.0的情況下,硅膠都會(huì)帶上負(fù)電荷,因而會(huì)使得能電離的化合物與硅膠作用,增強(qiáng)了這種附帶的次級作用力(主作用力為非極性相互作用力),而使得此類物質(zhì)在硅膠-C18上的保留增強(qiáng),若只考慮C18的非極性作用力,必然會(huì)導(dǎo)致回收結(jié)果不盡如人意。

3. 為什么在農(nóng)殘檢測過程中GCB常見于凈化模式,而不用于富集模式?

答:SPE的凈化模式常被用來吸附雜質(zhì),而富集模式常被用來吸附目標(biāo)物質(zhì),GCB是一種石墨化碳黑,它由六個(gè)碳原子構(gòu)成平面六角形,并且層疊而成,對于芳香平面分子,很容易嵌入,而具有較強(qiáng)吸附芳香化合物的選擇性,對于其他分析物也有較好的吸附性能,填料的吸附與解吸附的性能將直接影響填料的使用范圍,對于GCB而言,其吸附性能較強(qiáng),但是解吸附的可逆性稍差,需要選擇合適強(qiáng)度的溶劑來釋放被吸附的物質(zhì),因而造成了解析溶劑匹配較為困難,由于其對色素等的優(yōu)秀吸附性能,因而在農(nóng)殘樣品處理中,常用來吸附色素等雜質(zhì),而不是選擇用來保留目標(biāo)化合物。

4. 淋洗步驟通常需要抽真空干燥,這個(gè)原因是什么?

答:淋洗后通常要抽真空干燥,主要作以下考量:

1)通常由于反相萃取在化合物的前處理中使用的比較多,正如反相色譜在色譜中作為常見的分離方法一樣,在反相萃取中的淋洗液常為水相或者含水的緩沖溶液,去除水份,可以便于后續(xù)干燥濃縮步驟。

2)有的項(xiàng)目,在淋洗步驟完成后,直接用一定體積的洗脫液,比如1mL的甲醇洗脫,此過程將洗脫與定容集為一步處理,前一步的處理必然對洗脫步驟的定量結(jié)果產(chǎn)生影響。

3)便是溶劑互溶問題,當(dāng)淋洗步驟使用的溶劑極性與洗脫溶劑的極性差異較大時(shí),會(huì)產(chǎn)生乳化分層,洗脫阻力大,洗脫液被稀釋的風(fēng)險(xiǎn)等,導(dǎo)致洗脫效果的差異,以致于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的失敗。

5. 我們在使用硅膠鍵合填料類型的色譜柱的時(shí)候,出于對色譜學(xué)的常識,知道了硅膠鍵合填料一般廠商建議的pH使用范圍為2-8,那么對于使用硅膠鍵合的填料的固相萃取小柱,是否需要嚴(yán)格遵守這樣一條規(guī)定?

答:首先,我們需要了解到,廠家建議的pH2-8的耐受范圍,是為了保證色譜柱的正常使用壽命,當(dāng)pH值超出酸性范圍時(shí),鍵合相易發(fā)生水解而流失;當(dāng)pH超出堿性范圍時(shí),會(huì)加速硅膠的溶解。因此會(huì)損害色譜柱柱效和保留特性,但是我們知道這個(gè)pH耐受值范圍外的溶劑對于色譜柱的影響,主要是一個(gè)積累性的過程,在溶劑沖刷下,逐漸溶解而導(dǎo)致色譜柱性能改變和不可逆,壽命減短。SPE小柱和色譜柱的一個(gè)差異就是,SPE是一次性消耗品,在耐受的溶劑范圍外,短暫時(shí)間的溶劑沖刷對于小柱的保留特性影響甚微,并不會(huì)導(dǎo)致其保留顯著差異,因此其使用的pH范圍更寬,一般可以在pH值范圍1-10使用,而不會(huì)導(dǎo)致其結(jié)果的差異性。


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